• A
  • A
  • A
  • АБB
  • АБB
  • АБB
  • А
  • А
  • А
  • А
  • А
Обычная версия сайта

Глава

Микроскопические механизмы, лежащие в основе процесса образования белками фибриллярных наноструктур

С. 56-58.
Будылин Г. С., Ровнягина Н. Р., Тихонова Т. Н., Ширшин Е. А.

Термин амилоидоз обозначает группу заболеваний, вызванных неправильно
свернутыми белками, которые накапливаются в определенных тканях и органах и
приводят к нарушению их нормальных функций. Амилоидоз сопутствует диабету второго
типа, атеросклерозу, болезням Альцгеймера, Паркинсона и др. Неправильно свернутые
белки могут терять свои нативные свойства и образовывать нерастворимые агрегаты,
которые называются амилоидными фибриллами и характеризуются структурой, богатой
бета-листами. Они могут достигать 10-20 нм в диаметре и нескольких микрометров в
длину. Тема образования амилоидных фибрилл является одной из наиболее актуальных
тем в биохимии, молекулярной биологии и медицине.
Одним из наиболее распространённых маркеров для детектирования амилоидных
фибрилл и исследования кинетики их образования является тиофлавин Т (ThT). Данный
краситель специфически встраивается в фибриллярные агрегаты, при этом квантовый
выход его флуоресценции возрастает на 3 порядка по сравнению с водным раствором,
среднее время жизни флуоресценции возрастает от 200 пс до 2 нс [1].
Фотофизические аспекты формирования оптических свойств тиофлавина Т при
связывании его в фибриллярные агрегаты активно изучаются. Одна из общепринятых
гипотез утверждает, что тиофлавин Т встраивается в фибриллы по принципу
молекулярного ротора так, что усиление квантового выхода флуоресценции,
сопровождающее данный процесс, вызвано жесткой фиксацией молекулярных
фрагментов зонда [2]. В водном растворе после фотовозбуждения происходит
сверхбыстрая релаксация, связанная с внутримолекулярным переносом заряда (ВЗП) с
последующей торсионной релаксацией. Ограничение этого вращения в жесткой
микросреде предотвращает поворот колец и, следовательно, снижает эффективность
нерадиационного распада, связанного с ВЗП, что приводит к одновременному увеличению
интенсивности флуоресценции и времени жизни. Данная гипотеза была также проверена в

работах по исследованию изменения фотофизических параметров тиофлавина Т в средах с
различной вязкостью [3-5].
Однако, теория «молекулярного ротора» не объясняет несовпадение кинетики
изменения среднего времени жизни тиофлавина Т при встраивании в фибриллы и
изменения интенсивности флуоресценции зонда при фибрилообразовании. В работе [6] с
помощью метода ап-конверсии было показано наличие двух различных мод встраивания
красителя. Фотофизческие характеристики тиофлавина Т в данных сайтах различаются
значительно: среднее время жизни флуоресценции зонда, встроенного в сайт со слабым
связыванием, составляет 2 нс, а для сайта с высокой афинностью - 2 пс. Более того,
существует ряд работ, в которых продемонстрирована способность нативных белков
связывать тиофлавин Т, сопровождающаяся ростом среднего времени жизни до значения
около 1 нс, сравнимого с данным параметром для системы фибриллы-ThT, и всего лишь
десятикратным усилением флуоресценции красителя [7, 8]. Таким образом, возникает
необходимость более детально исследовать процесс связывания тиофлавина Т в
различные системы, определить параметры мод встраивания и изменение фотофизических
характеристик ThT в результате данного процесса.
Данная работа посвящена изучению оптических свойства ThT в ряде систем с
различной структурой: (1) фибриллярные агрегаты; (2) префибриллярные агрегаты,
являющиеся наиболее токсичными для организма человека, (3) различные глобулярные
белки и их неспецифические агрегаты. С использованием стационарной и время-
разрешенной флуоресцентной спектроскопии для всех исследуемых структур были
определены константы образования комплекса с зондом, среднее время жизни
флуоресценции и усиление флуоресценции тиофлавина Т. С использованием метода ап-
конверсии были исследованы фотофизические характеристики при связывании зонда в
белки и белковые агрегаты. Данные результаты позволят продвинуться в понимании
механизма связывания красителя с различными объектами и предоставят новые
возможности мониторинга процессов агрегации с использованием ThT.
Работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ 17-52-04103 Бел_мол_а и
РФФИ 16-32-60168 мол_а_дк.

Литература
1) Mohanty, J., Choudhury, S. D., Pal, H., & Bhasikuttan, A. C. (2012). Early detection of
insulin fibrillation: a fluorescence lifetime assay to probe the pre-fibrillar regime. Chemical
Communications, 48(18), 2403-2405.

2) Freire, S., de Araujo, M. H., Al-Soufi, W., & Novo, M. (2014). Photophysical study of
Thioflavin T as fluorescence marker of amyloid fibrils. Dyes and Pigments, 110, 97-105.
3) Amdursky, N., Erez, Y., & Huppert, D. (2012). Molecular rotors: what lies behind the high
sensitivity of the thioflavin-T fluorescent marker. Accounts of chemical research, 45(9), 1548-
1557.
4) Stsiapura, V. I., Maskevich, A. A., Kuzmitsky, V. A., Uversky, V. N., Kuznetsova, I. M., &
Turoverov, K. K. (2008). Thioflavin T as a molecular rotor: fluorescent properties of thioflavin T
in solvents with different viscosity. The Journal of Physical Chemistry B, 112(49), 15893-15902.
5) Voropai, E. S., Samtsov, M. P., Kaplevskii, K. N., Maskevich, A. A., Stepuro, V. I., Povarova,
O. I., ... & Uverskii, V. N. (2003). Spectral properties of thioflavin T and its complexes with
amyloid fibrils. Journal of Applied Spectroscopy, 70(6), 868-874
6) Singh, P. K., Mora, A. K., & Nath, S. (2015). Ultrafast fluorescence spectroscopy reveals a
dominant weakly-emissive population of fibril bound thioflavin-T. Chemical Communications,
51(74), 14042-14045.
7) Rovnyagina, N. R., Sluchanko, N. N., Tikhonova, T. N., Fadeev, V. V., Litskevich, A. Y.,
Maskevich, A. A., & Shirshin, E. A. (2018). Binding of thioflavin T by albumins: An
underestimated role of protein oligomeric heterogeneity. International journal of biological
macromolecules, 108, 284-290.
8) Sen, P., Fatima, S., Ahmad, B., & Khan, R. H. (2009). Interactions of thioflavin T with serum
albumins: spectroscopic analyses. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular
Spectroscopy, 74(1), 94-99.












































































В книге

М.: Физический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 2019.